如何提高RT-PCR反應檢測RNA的靈敏度

在進行基因研究的過程中，我們經常會遇到RNA樣本不足的情況，例如研究微小的解剖口腔腫瘤，甚至是單細胞樣本，以及在人體細胞中轉錄水平很低的特定基因突變樣本。當然，對於COVID-19檢測，如果採樣時拭子位置不對或次數不夠，樣本量會很低，這也是衛計委前兩天出來的原因，檢測合格，核酸採樣器沒有採集6個樣本的，可以報告。

試劑的靈敏度很重要，因為我們有這個問題或那個問題，那麼我們可以做些什麼來提高RT-PCR的靈敏度呢？

在我們討論可能的解決方案之前，讓我們先提一下我們剛才提到的情況的兩大並發症。

首先，當我們的樣本中只有少數細胞群時，我們擔心 RNA 丟失。如果採用傳統的分離清洗方法，如柱法或核酸沉澱法，極有可能導致少量樣品丟失。一種解決方案是添加載體分子，例如 tRNA，但即便如此，也不能保證我們的恢復實驗正常。

那麼什麼是更好的方法呢？培養細胞或顯微解剖樣品的一個很好的選擇是使用直接裂解。

思路是將細胞裂解5分鐘，將RNA釋放到溶液中，然後停止反應2分鐘，然後將裂解物直接加入逆轉錄反應中，這樣RNA就不會丟失，最後將得到的cDNA直接放入進入實時反應。

但是，如果由於起點有限或目標基因表達量小，我們可以回收所有 RNA，但仍然無法提供足夠的模板來獲得良好的實時信號，該怎麼辦？

在這種情況下，預放大步驟可能非常有用。

以下是逆轉錄後增加靈敏度的方案。在開始之前，我們需要詢問下游我們感興趣的目標是什麼，從而為這些目標設計特異性引物進行預擴增。

這可以通過創建具有多達 100 對引物和 10 到 14 次反應循環的混合引物來實現。因此，需要專門為此要求設計的 Master Mix 來預放大獲得的 cDNA。

將循環次數設置在 10 到 14 之間的原因是，這種有限的循環次數確保了各個目標之間的隨機性，這對於需要定量分子信息的研究人員來說至關重要。

預擴增後，我們可以獲得大量的cDNA，從而大大提高了後端的檢測靈敏度，甚至可以將樣本稀釋後進行多次real-time PCR反應，以消除可能出現的隨機誤差。